十四、保健食品中腺苷的测定
Determination of adenosine in health food
1. 范围
本方法规定了保健食品中腺苷的高效液相色谱测定方法。
本方法适用于保健食品中腺苷的测定。
2. 原理
试样经水超声提取，用高效液相色谱进行测定，以保留时间定性，峰面积外标法定量。
3. 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.2 甲醇(CH3OH)：色谱纯。
3.1.3 硅藻土(SiO2)：化学纯。
3.2 试剂配制
0.01mol/L磷酸二氢钾溶液：称取1.36 g磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至1000 mL。经0.45 μm微孔滤膜过滤后使用。
3.3 标准品
腺苷(C10H13N5O4)：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 腺苷标准储备液(1.0 mg/mL)：精密称取10 mg (精确到0.1 mg)腺苷标准品于10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀。
3.4.2 腺苷标准中间液(100 μg/mL)：精密吸取腺苷标准储备液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
3.4.3 腺苷标准工作液：精密吸取腺苷标准中间液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得浓度为1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、50.0 μg/mL的标准工作液。
4. 仪器设备
4.1 分析天平：感量为0.1 mg，0.01 mg。
4.2 超声波提取器。
4.3 离心机。
4.4 高效液相色谱仪：配有紫外(UV)检测器或二极管阵列(DAD)检测器。
5. 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 试样处理
5.1.1.1 固体试样
称取粉碎并混合均匀的试样0.5 g~2 g (精确到0.001 g) (含待测组分约0.05 mg ~2.5 mg)于50 mL容量瓶中，加入水约30 mL，超声提取20 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，以3000 rpm/min离心5 min。经0.45μm水系滤膜过滤后，取续滤液供液相色谱分析用。
5.1.1.2 软胶囊试样
取试样剪开，挤出内容物并混匀，称取0.5 g~2 g (精确到 0.001 g)，加入等量硅藻土，研至分散均匀，称取其中部分 (精确到0.001g，含待测组分约0.05 mg ~2.5 mg)，转移至250 mL具塞三角瓶中，并吸取50 mL水，并入三角瓶中，称重，加塞超声提取20 min，放冷，用水补足重量，摇匀，静置澄清或以3000r/min离心5 min。取上清液经0.45 μm水系滤膜过滤后，续滤液供液相色谱分析用。
5.1.1.3 液体试样
精密量取混匀的试样5.0 mL ~10.0 mL (含待测组分约0.05 mg ~2.5 mg)于50 mL容量瓶中，加入水约30 mL，超声提取20 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，以3000r/min离心5min。经0.45μm水系滤膜过滤后，取续滤液供液相色谱分析用。
5.1.2 稀释
根据试样中腺苷的含量用水进行适当的稀释(F)，使待测溶液中腺苷浓度在1.0 μg/mL~50.0 μg/mL范围内。
5.2 液相色谱参考条件
5.2.1 色谱柱：C18柱4.6×250 mm，5 μm或同等性能色谱柱。
5.2.2 柱温：室温。
5.2.3 检测波长：254 nm。
5.2.4 流动相：甲醇+0.01mol/L磷酸二氢钾溶液=10+90。
5.2.5 流速：1.0 mL/min。
5.2.6 进样量：10 μL。
5.3 标准曲线的制作
将腺苷标准工作液(3.4.3)从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(标准溶液液相色谱图见附录A中图A.1)。
5.4 试样溶液的测定
在相同色谱条件下，将待测溶液(5.1.1.1、5.1.1.2、5.1.1.3、5.1.2)注入高效液相色谱仪中，以保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线计算待测溶液中腺苷的浓度(待测溶液液相色谱图见附录A中图A.2)。
6. 分析结果的表述
试样中腺苷含量按式(1)计算：
...................................(1)
式中:
X——试样中腺苷的含量，固态试样单位为毫克每百克(mg/100g)，液态试样单位为毫克每百毫升(mg/100 mL)；
ρ——根据标准曲线计算得到的待测溶液中腺苷的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——试样稀释或定容体积，单位为毫升(mL)；
F——稀释倍数；
m——试样取样质量，单位为克(g)；试样取样体积，单位为毫升(mL)；
100——单位转换；
1000——单位转换。
计算结果以重复条件下获得的两次；测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
7. 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。
8. 其他
当称样量为2.0g时，定容体积为50 mL时，腺苷的定量限为1.5mg/100g。
当取样量为10 mL时，定容体积为50 mL时，腺苷的定量限为0.30mg/100mL。
附录 A
标准溶液和待测溶液典型高效液相色谱图
A.1 腺苷标准溶液色谱图，见图A.1。
图A.1 腺苷标准溶液色谱图
A.2 含有腺苷的待测溶液色谱图，见图A.2。
图A.2 含有腺苷的待测溶液色谱图
十五、保健食品中总皂苷的测定
Determination of total ginsenosides in health food
1. 范围
本标准规定了保健食品中总皂苷的分光光度测定方法。
本标准适用于保健食品中总皂苷含量的测定。
2. 原理
试样用水提取总皂苷类成分，经大孔树脂柱或水饱和正丁醇萃取除杂后，试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，采用分光光度法测定560 nm波长处的吸光度，进行定量。
3. 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 Amberlite-XAD-2 大孔树脂（或D-101大孔树脂）。
3.1.2 中性氧化铝：层析用（100-200目）。
3.1.3 正丁醇(CH3(CH2)2CH2OH)。
3.1.4 无水乙醇(CH3CH2OH)。
3.1.5 甲醇(CH3OH)。
3.1.6 氨水(NH3)。
3.1.7 高氯酸(HClO4)。
3.1.8 冰乙酸 (CH3COOH)。
3.1.9 香草醛(C8H8O3)。
3.2 试剂配制
3.2.1 香草醛溶液（5%）：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100mL，混匀。
3.2.2 水饱和正丁醇溶液：取正丁醇适量，加入适量水，充分振摇，静置使分层，上层液体即为水饱和正丁醇。
3.2.3 氨试液：取氨水40mL，加水使成100mL，混匀。
3.3 标准品
人参皂苷Re (C48H82O18)。
3.4 标准溶液的配制
人参皂苷Re标准储备液(0.2 mg/mL)：准确称取10.0 mg 人参皂苷Re标准品（精确至0.1 mg）于 50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。
4. 仪器设备
4.1 紫外/可见分光光度计。
4.2 天平：感量为 1 mg 和 0.1 mg。
4.3 超声波清洗器。
4.4 离心机：转速 ≥4000 r/min。
4.5 恒温水浴锅。
5. 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 试样处理
5.1.1.1 固体试样
称取已粉碎混合均匀的待测试样1 g(精确至 0.001 g)（或根据试样含总皂苷量定），置于具塞锥形瓶中，加入水100.0 mL，称重，超声30 min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
5.1.1.2液体试样
含乙醇的液体试样，吸取混合均匀的待测试样10.0 mL（或根据试样含总皂苷量定）置水浴上挥尽乙醇后，用水转移至10mL容量瓶中，并用水稀释至刻度，备用；非乙醇类的液体试样，直接取样。
5.1.2 去除杂质（可根据样品性质选择以下一种方法）
5.1.2.1 大孔树脂柱层析法
用10 mL注射器作层析管，内装3cm大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。先用25 mL70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用约25 mL水洗脱至无醇味，弃去洗脱液，加入1.0 mL已处理好的试样溶液（5.1.1.1，5.1.1.2），用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL或以上70%乙醇洗脱人参皂苷至洗脱液无色，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，残渣用少量甲醇溶解并转移至10mL具塞比色管中，备用。
5.1.2.2 水饱和正丁醇萃取法
取5.1.1.1项下备用溶液25.0 mL置分液漏斗中；或将5.1.1.2项下备用溶液用水全部转移至分液漏斗中（非乙醇类液体试样直接取10.0 mL）并加水至约25mL。加入20 mL水饱和正丁醇（3.2.2）振摇萃取，分取正丁醇液（必要时可离心），重复操作3次，合并正丁醇液用20 mL氨试液（3.2.3）洗涤，重复操作2次，弃去氨试液，正丁醇液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中（液体样品则转移至10 mL量瓶中），加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，备用。
5.2 标准曲线的制作
吸取人参皂苷Re标准溶液（3.4）0 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于10 mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2 mL香草醛冰乙酸溶液（3.2.1），再加入0.8 mL高氯酸（3.1.7），混匀，使残渣全部溶解，置60℃水浴中加热10 min，取出，冰浴冷却后，加入5.0 mL冰乙酸（3.1.8），摇匀后，立即于560 nm波长处测定吸光度。
5.3 试样溶液的测定
取5.1.2.1项下备用溶液，或者吸取5.1.2.2 项下备用溶液1.0 mL于10 mL具塞比色管中，从5.2 “置水浴中挥干溶剂……”起，与标准溶液同法测定吸光度。
5.4 结果校正（如样品不存在背景干扰，无需校正）照5.1.2.1同法制备备用溶液，或者吸取5.1.2.2 项下备用溶液1.0 mL于10 mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2 mL冰乙酸（3.1.8），从5.2 “再精密加入0.8 mL高氯酸（3.1.7）……”起，与试样同法测定吸光度，做试样背景校正。
6. 分析结果的表述
试样中总皂苷含量（以人参皂苷Re计）按式（1）计算:
Ci ×V×100
Xi = ..........................................(1)
V0×m
式中:
Xi——试样中总皂苷的含量（以人参皂苷Re计），单位为毫克每百克（mg/100g）或毫克每百毫升（mg/100mL）；
Ci——经试样背景校正后，由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量，单位为毫克( mg)；
V——被测定样液的定容体积，单位为毫升( mL)；
V0——被测定样液的显色体积，单位为毫升( mL)；
m——试样的称样质量，单位为克( g)；
100——单位转换。
计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
7. 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10% 。
8. 其他
